Lionel Andrés Messi dilahirkan pada 24 Jun 1987 di Rosario dan merupakan anak ketiga daripada empat orang adik-beradik hasil perkongsian hidup Jorge Messi, seorang pengurus kilang besi dan isterinya Celia Cuccittini, yang bekerja di bengkel pengeluaran magnet. Disebelah bapanya, bapanya merupakan keturunan Itali dan Sepanyol, merupakan cicit kepada imigran yang berasal dari Marche dan Catalonia, manakala di sebelah ibunya pula, ibunya berketurunan Itali[5]. Dibesarkan dalam suasana menyayangi bola sepak, "Leo" memiliki semangat bermain bola sepak pada zaman awalnya, bermain hampir setiap hari bersama abang-abangnya, Rodrigo dan Matías, dan sepupunya, Maximiliano dan Emanuel Biancucchi, yang kedua-duanya menjadi pemain profesional[6]. Pada umur empat tahun, beliau menyertai kelab tempatan Grandoli, di mana beliau telah dilatih oleh bapanya, walaupun beliau dipengaruhi oleh nenek sebelah ibunya, Celia, pada waktu awal beliau berkecimpung dalam bola sepak, di mana neneknya akan menemani beliau semasa sesi latihan dan perlawanan[7]. Messi berasa sangat terkesan setelah kematian neneknya, tidak lama sebelum ulangtahun kelahiran beliau yang ke-11 dan semenjak itu, sebagai penganut Katolik, beliau akan meraikan jaringan golnya dengan melihat dan menunjukkan ke arah langit sebagai tanda penghargaan kepada mendiang neneknya[8][9].

Messi menyertai kelab Newell's Old Boys pada umur enam tahun. Sepanjang enam tahun beliau bermain bersama kelab Newell's, beliau telah menjaringkan hampir 500 gol sebagai sebahagian daripada kumpulan "The Machine of '87", gelaran pasukan kelab pada ketika itu yang hampir mustahil dikalahkan dan dinamakan dengan tahun kelahiran, dimana kumpulan ini juga menghiburkan orang ramai yang datang dengan melakukan helah bola sepak selepas berakhirnya separuh masa pertama[11][12]. Walau bagaimanapun, masa depan beliau sebagai pemain profesional bakal terancam apabila beliau didiagnosis dengan penyakit berkaitan kekurangan hormon pertumbuhan (GHD) semasa berumur 10 tahun[12]. Insurans kesihatan bapanya hanya meliputi dua tahun rawatan hormon pertumbuhan, di mana kos yang perlu ditanggung sekurang-kurangnya $10900 sebulan, Newell bersetuju untuk menyumbang, tetapi kemudian mengingkari janji mereka[13]. Messi kemudian ditinjau oleh kelab River Plate yang terdiri daripada pemain idola beliau, Pablo Aimar, namun begitu mereka juga tidak mampu menanggung kos rawatan akibat krisis ekonomi yang dihadapi negara Argentina ketika itu[14][15].

Disebabkan keluarga Messi mempunyai kenalan di Catalonia, mereka cuba menguruskan perlawanan ujian bersama kelab Barcelona pada bulan September 2000. Pengarah pasukan utama Charly Rexach ingin mendapatkan khidmat Messi, namun begitu lembaga pengarah kelab menolak atas alasan kelab Eropah jarang sekali menandatangani kontrak pemain luar pada usia yang sangat muda. Pada 14 Disember, kata dua telah diberikan kepada Barcelona untuk membuktikan komitmen ini, dan Rexach, dengan tiada kertas disediakan, menyediakan kontrak di atas kertas tisu[14][16]. Pada bulan Februari 2001, keluarga Messi berpindah ke Barcelona, di mana mereka mendiami di sebuah pangsapuri berdekatan dengan stadium Camp Nou, iaitu stadium tuan rumah untuk kelab Barcelona. Pada tahun pertama Messi di Sepanyol, beliau jarang sekali membuat penampilan bersama akademi disebabkan konflik perpindahan dengan kelab Newell's; dan sebagai pemain asing, beliau hanya boleh diturunkan dalam perlawanan persahabatan dan liga Catalan. Tanpa bola sepak, beliau bergelut untuk mendapatkan keserasian bersama pasukannya. Di rumah pula, beliau mula merindui kampung halamannya di Argentina setelah ibunya pulang kembali ke Rosario bersama abang-abangnya dan adik perempuannya, María Sol, manakala bapanya menemani beliau di Sepanyol[11][16][17].

Selepas setahun bersama akademi bola sepak Barcelona, La Masia, Messi akhirnya diterima oleh Persekutuan Bola Sepak Diraja Sepanyol (RFEF) pada bulan Februari 2002. Dibenarkan bermain dalam semua pertandingan, beliau cuba berkenalan dengan pasukannya, antaranya ialah Cesc Fàbregas dan Gerard Piqué[18]. Selepas selesai menjalani rawatan hormon pertumbuhan semasa berumur 14 tahun[19], Messi merupakan sebahagian daripada "Baby Dream Team", pasukan belia paling terbaik dimiliki Barcelona. Pada musim penuh pertamanya (2002-03), beliau merupakan penjaring gol terbanyak dengan 36 gol dalam 30 perlawanan untuk pasukan Cadetes A, yang memenangi kejuaraan treble; memenangi liga serta piala di peringkat negara dan Catalan[18][20]. Perlawanan akhir Copa Catalunya menentang Espanyol yang berkesudahan Barcelona memenangi 4-1, digelar di peringkat dalaman kelab sebagai partido de la máscara, perlawanan akhir bertopeng. Gelaran ini diberi oleh kerana dalam perlawanan liga sebelum itu, Messi mengalami patah tulang di bahagian pipi dan pasukan perubatan memberi kebenaran kepada Messi untuk bertanding dalam perlawanan akhir dengan syarat, beliau perlu memakai perlindungan plastik pada muka; yang dalam perlawanan akhir tersebut, beliau membuka topeng tersebut dan menjaringkan dua gol dalam masa 10 minit sebelum pertukaran pemain[21]. Sebelum berakhirnya musim domestik, beliau menerima tawaran dari kelab Arsenal, tawaran kelab asing pertama beliau, namun begitu memilih untuk kekal di Barcelona selepas rakan pasukannya Fàbregas dan Piqué memilih untuk beraksi di England[16][22][23].